İsviçre'nin Nyon kentinde yapılan kura çekimine, grup maçlarının ardından gruplarında ilk 2 sırayı alan 16 takım katıldı. Kura çekimi sonunda eşleşen takımlar, 2. tur ilk maçlarını 24-25 Şubat 2009 tarihlerinde, rövanşlarını ise 10-11 Mart 2009 tarihlerinde oynayacak ve bu maçlar sonunda çeyrek finale yükselen 8 takım belirlenecek.
Kura sonunda eşleşmeler şu şekilde gerçekleşti:
Inter Milan (İtalya) - Manchester United (İngiltere)
Arsenal (İngiltere) - AS Roma (İtalya)
Villarreal (İspanya) - Panathinaikos (Yunanistan)
Lyon (Fransa) - Barcelona (İspanya)
Real Madrid (İspanya) - Liverpool (İngiltere)
Sporting Lisbon (Portekiz) - Bayern Münih (Almanya)
Atletico Madrid (İspanya) - FC Porto (Portekiz)
Chelsea (İngiltere) - Juventus (İtalya)